Uudised - Lahustunud hapniku taseme jälgimine biofarmatseutilise kääritamisprotsessi käigus

Mis on lahustunud hapnik?

Lahustunud hapnik (DO) viitab molekulaarsele hapnikule (O_₂), mis on vees lahustunud. See erineb veemolekulides esinevatest hapnikuaatomitest (H_₂O), kuna see esineb vees iseseisvate hapnikumolekulide kujul, mis pärinevad kas atmosfäärist või tekivad veetaimede fotosünteesi teel. Lahustuva hapniku kontsentratsiooni mõjutavad mitmesugused tegurid, sealhulgas temperatuur, soolsus, veevool ja bioloogiline aktiivsus. Seega on see oluline näitaja veekeskkonna tervise ja reostuse seisundi hindamisel.

Lahustunud hapnik mängib olulist rolli mikroobide ainevahetuse edendamisel, mõjutades rakkude hingamist, kasvu ja ainevahetusproduktide biosünteesi. Siiski ei ole kõrgem lahustunud hapniku tase alati kasulik. Liigne hapnik võib viia akumuleerunud produktide edasise metabolismini ja potentsiaalselt põhjustada toksilisi reaktsioone. Optimaalsed lahustunud hapniku tasemed on erinevate bakteriliikide lõikes erinevad. Näiteks penitsilliini biosünteesi ajal püsib lahustunud hapniku tase tavaliselt umbes 30% õhu küllastuse juures. Kui lahustunud hapniku tase langeb nulli ja püsib sellel tasemel viis minutit, võib produktide moodustumine oluliselt kahjustuda. Kui see seisund püsib 20 minutit, võib tekkida pöördumatuid kahjustusi.

Praegu suudavad kõige sagedamini kasutatavad DO-andurid mõõta ainult suhtelist õhu küllastust, mitte lahustunud hapniku absoluutset kontsentratsiooni. Pärast söötme steriliseerimist õhutatakse ja segatakse, kuni anduri näit stabiliseerub, mille järel väärtus seatakse 100% õhu küllastusele. Järgnevad mõõtmised käärimisprotsessi ajal põhinevad sellel võrdlusväärtusel. Absoluutseid DO väärtusi ei saa määrata standardsete andurite abil ja see nõuab keerukamaid tehnikaid, näiteks polarograafiat. Õhu küllastuse mõõtmised on aga üldiselt piisavad käärimisprotsesside jälgimiseks ja juhtimiseks.

Fermenteris võivad lahustunud hapniku tasemed (DO) eri piirkondades varieeruda. Isegi kui mingil hetkel saadakse stabiilne näit, võib teatud söötmetes siiski esineda kõikumisi. Suuremates fermenterites kipuvad DO tasemed olema ruumiliselt varieeruvad suuremalt, mis võib oluliselt mõjutada mikroobide kasvu ja tootlikkust. Eksperimentaalsed tõendid on näidanud, et kuigi keskmine DO tase võib olla 30%, on fermentatsiooni jõudlus kõikuvates tingimustes oluliselt madalam kui stabiilsetes tingimustes. Seetõttu on fermentaatorite skaleerimisel – lisaks geomeetrilisele ja võimsuse sarnasusele – ruumiliste DO kõikumiste minimeerimine endiselt peamine uurimiseesmärk.

Miks on lahustunud hapniku jälgimine biofarmatseutilises fermentatsioonis oluline?

1. Mikroorganismide või rakkude optimaalse kasvukeskkonna säilitamiseks
Tööstuslik kääritamine hõlmab tavaliselt aeroobseid mikroorganisme, näiteks Escherichia coli ja pärmi, või imetajarakke, näiteks hiina hamstri munasarjarakke (CHO). Need rakud toimivad kääritussüsteemis "töötajatena", vajades hingamiseks ja ainevahetuseks hapnikku. Hapnik toimib aeroobses hingamises terminaalse elektronaktseptorina, võimaldades energia tootmist ATP kujul. Ebapiisav hapnikuvarustus võib põhjustada rakkude lämbumist, kasvu peatumist või isegi rakusurma, mis lõppkokkuvõttes viib käärimise ebaõnnestumiseni. DO taseme jälgimine tagab, et hapniku kontsentratsioon püsib optimaalses vahemikus rakkude püsiva kasvu ja elujõulisuse jaoks.

2. Sihttoodete tõhusa sünteesi tagamiseks
Biofarmatseutilise fermentatsiooni eesmärk ei ole ainult rakkude proliferatsiooni soodustamine, vaid ka soovitud sihtproduktide, näiteks insuliini, monoklonaalsete antikehade, vaktsiinide ja ensüümide tõhusa sünteesi hõlbustamine. Need biosünteesi rajad vajavad sageli märkimisväärset energiapanust, mis pärineb peamiselt aeroobsest hingamisest. Lisaks sõltuvad paljud produktide sünteesis osalevad ensümaatilised süsteemid otseselt hapnikust. Hapnikupuudus võib neid radasid häirida või nende efektiivsust vähendada.

Lisaks toimivad lahustunud hapniku tasemed regulatiivse signaalina. Nii liiga kõrge kui ka liiga madal lahustunud hapniku kontsentratsioon võib:
- Muuta rakkude ainevahetusradasid, näiteks nihutades aeroobset hingamist vähem efektiivsele anaeroobsele käärimisele.
- Vallandavad rakulisi stressireaktsioone, mis viib soovimatute kõrvalsaaduste tekkeni.
- Mõjutab eksogeensete valkude ekspressioonitaset.

DO taseme täpse kontrollimise abil kääritamise eri etappides on võimalik suunata rakkude ainevahetust maksimaalse sihtprodukti sünteesi suunas, saavutades seeläbi suure tiheduse ja suure saagikusega kääritamise.

Sissejuhatus biofarmatseutiliste toodete veevooskeemi

3. Hapnikupuuduse või liigse hapniku vältimiseks
Hapnikupuudusel (hüpoksial) võivad olla tõsised tagajärjed:
- Rakkude kasv ja produktide süntees lakkavad.
- Ainevahetus nihkub anaeroobsetele radadele, mille tulemusel kogunevad orgaanilised happed, näiteks piimhape ja äädikhape, mis alandavad söötme pH-d ja võivad rakke mürgitada.
- Pikaajaline hüpoksia võib põhjustada pöördumatuid kahjustusi, kusjuures taastumine on puudulik isegi pärast hapnikuvarustuse taastamist.

Liigne hapnik (üleküllastumine) kujutab endast ka riske:
- See võib esile kutsuda oksüdatiivse stressi ja reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) teket, mis kahjustavad rakumembraane ja biomolekule.
- Liigne õhutamine ja segamine suurendavad energiatarbimist ja tegevuskulusid, mis toob kaasa tarbetu ressursiraiskamise.

4. Reaalajas jälgimise ja tagasiside juhtimise kriitilise parameetrina

DO on reaalajas mõõdetav, pidev ja kõikehõlmav parameeter, mis peegeldab kääritussüsteemi sisemisi tingimusi. DO taseme muutused võivad tundlikult viidata mitmesugustele füsioloogilistele ja operatiivsetele seisunditele:
- Kiire rakkude kasv suurendab hapnikutarbimist, põhjustades lahustunud hapniku taseme langust.
- Substraadi ammendumine või pärssimine aeglustab ainevahetust, vähendades hapnikutarbimist ja põhjustades lahustunud hapniku taseme tõusu.
- Võõrmikroorganismidega saastumine muudab hapniku tarbimise mustrit, põhjustades lahustunud hapniku ebanormaalseid kõikumisi ja toimides varajase hoiatussignaalina.
- Seadmete talitlushäired, näiteks segisti rike, ventilatsioonitoru ummistus või filtri saastumine, võivad samuti põhjustada lahustunud hapniku ebanormaalset käitumist.

Reaalajas DO jälgimise integreerimisega automatiseeritud tagasiside juhtimissüsteemi saab DO taseme täpset reguleerimist saavutada järgmiste parameetrite dünaamilise reguleerimise abil:
- Segamiskiirus: kiiruse suurendamine parandab gaasi ja vedeliku kontakti mullide lõhkumise teel, parandades seeläbi hapnikuülekande efektiivsust. See on kõige sagedamini kasutatav ja tõhusam meetod.
- Õhustuskiirus: sisselaskegaasi voolukiiruse või koostise reguleerimine (nt õhu või puhta hapniku osakaalu suurendamine).
- Paagi rõhk: rõhu tõstmine suurendab hapniku osarõhku, parandades seeläbi lahustuvust.
- Temperatuur: Temperatuuri langetamine suurendab hapniku lahustuvust kultuurikeskkonnas.

BOQU tootesoovitused bioloogilise kääritamise online-jälgimiseks: